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Ligandenidentifizierung
Interaktion niedermolekularer Liganden mit therapeutisch relevanten Proteinen
In Zeiten häufig auftretender Resistenzen gegenüber bekannten Wirkstoffen wird es immer wichtiger, neue Substanzen zu finden, die Zielstrukturen potenter und selektiver angreifen. Ein Forschungsschwerpunkt des Zentrums für Pharmakologie beschäftigt sich daher mit der Untersuchung der molekularen Interaktionen von niedermolekularen, wirkstoffartigen Verbindungen (Liganden) mit medizinisch bzw. therapeutisch relevanten Zielstrukturen, wie Enzymen und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Dies erfolgt in enger Zusammenarbeit mit Arbeitsgruppen aus Medizinischen und Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultäten verschiedener Universitäten sowie in Kooperation mit externen Forschungseinrichtungen.
Hierbei kommen vielfältige Arbeitstechniken zum Einsatz, wie zum Beispiel die Zell- und Bakterienkultur, die Expression von rekombinanten Proteinen, die Analyse und Quantifizierung der Interaktion von Liganden mit ihren Zielstrukturen – vorrangig durch spektrophotometrische und fluorimetrische Methoden sowie die Auswertung dieser Interaktionen unter Zuhilfenahme verschiedener mathematischer Modelle.
In diesem Projekt wird die Interaktion der Untereinheiten der Proteinkinase CK2 (CK2α bzw. CK2α‘ und CK2β) und deren Beeinflussung durch Inhibitoren untersucht. Proteinkinase CK2 wird in verschiedenen Tumoren überexprimiert und fördert durch ihren antiapoptotischen Effekt das Überleben der Tumorzellen. Für die Entwicklung von Hemmstoffen des Enzyms wird ein alternativer Ansatz verfolgt, bei dem nicht das aktive Zentrum der Kinase, sondern die Bindungstelle der CK2-Untereinheiten der pharmakologische Angriffspunkt ist. Hierdurch sollen Hemmstoffe gefunden werden, die einerseits selektiver in ihrer biologischen Wirkung sind und andererseits als Tools eingesetzt werden können, um zelluläre Effekte einer gestörten CK2-Quartärstruktur zu untersuchen. Zur initialen Identifizierung und Analyse solcher Inhibitoren kommen verschiedene neuentwickelte Bindungsassays unter Verwendung der humanen CK2-Untereinheiten (rekombinant in E. coli exprimiert) sowie eines von CK2β abgeleiteten Peptids zum Einsatz. Weiterführend wird die Hemmwirkung auf die Kinaseaktivität der CK2 sowie die cytotoxische Wirkung der Verbindungen auf Tumor- und Nichttumorzellen untersucht.
Ausgewählte Publikationen:
Kröger, L.; Daniliuc, C. G.; Ensan, D.; Borgert, S.; Nienberg, C.; Lauwers, M.; Steinkrüger, M.; Jose, J.; Pietsch, M.; Wünsch, B. Synthesis and SAR of tetracyclic inhibitors of protein kinase CK2 derived from furocarbazole W16. ChemMedChem 2020, 15, 871-881.[Pubmed]
Pietsch, M.; Viht, K.; Schnitzler, A.; Ekambaram, R.; Steinkrüger, M.; Enkvist, E.; Nienberg, C.; Nickelsen, A.; Lauwers, M.; Jose, J.; Uri, A.; Niefind, K. Unexpected CK2β-antagonistic functionality of bisubstrate inhibitors targeting protein kinase CK2. Bioorg. Chem. 2020, 96:103608.[Pubmed]
Lindenblatt, D.; Horn, M.; Götz, C.; Niefind, K.; Neundorf, I.; Pietsch, M. Design of CK2β-mimicking peptides as tools to study the CK2α/CK2β interaction in cancer cells. ChemMedChem 2019, 14, 833-841.[Pubmed]
Hochscherf, J.; Lindenblatt, D.; Steinkrüger, M.; Yoo, E.; Ulucan, Ö.; Herzig, S.; Issinger, O.-G.; Helms, V.; Götz, C.; Neundorf, I.; Niefind, K.; Pietsch, M. Development of a HTS-compatible assay to identify inhibitors of the CK2a/CK2ß interaction. Anal. Biochem. 2015, 468, 4-14.[Pubmed]
Ziel des Projektes ist die Entwicklung neuer Inhibitoren des Enzyms Transglutaminase 2 (TGase 2). Die Expression der TGase 2 ist in verschiedenen Tumorarten hochreguliert und korreliert mit deren Chemo- und Strahlenresistenz sowie deren invasivem Potential. Im Rahmen dieses Projektes werden niedermolekulare Verbindungen synthetisiert und hinsichtlich ihrer Hemmeigenschaften gegenüber TGase 2 und anderen Transglutaminasen kinetisch charakterisiert. Hierfür notwendige Fluoreszenz- und Fluoreszenzanisotropie-basierte Assays zur Bestimmung der Hydrolase- bzw. Transamidaseaktivität der TGase 2 wurden bereits entwickelt und neuartige Inhibitoren an rekombinanter humaner TGase 2 sowie an TGase 2 aus Meerschweinchenleber kinetisch charakterisiert. Die laufenden Studien beschäftigen sich mit der Weiterentwicklung bereits identifizierter Hemmstoffe des aktiven Zentrums sowie der Entwicklung neuartiger, allosterisch wirkender Inhibitoren inkl. der Assaymethoden zur Quantifizierung ihres inhibitorischen Potentials. Die so gewonnenen Informationen werden genutzt, um radioaktiv markierte Sonden für die Diagnostik bzw. die Therapie verschiedener Tumorerkrankungen zu entwickeln.
Ausgewählte Publikationen:
Hauser, S.; Sommerfeld, P.; Wodtke, J.; Hauser, C.; Schlitterlau, P.; Pietzsch, J.; Löser, R.; Pietsch, M.; Wodtke, R. Application of a fluorescence anisotropy-based assay to quantify transglutaminase 2 activity in cell lysates. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23:4475.[Pubmed]
Wodtke, R.: Wodtke, J.; Hauser, S.; Laube, M.; Bauer, D.; Rothe, R.; Neuber, C.; Pietsch, M.; Kopka, K.; Pietzsch, J. Löser, R. Development of an 18F-labeled irreversible inhibitor of transglutaminase 2 as radiometric tool for quantitative expression profiling in cells and tissues. J. Med. Chem. 2021, 64, 3462-3478.[Pubmed]
Wodtke, R.; Hauser, C.; Ruiz-Gómez, G.; Jäckel, E.; Bauer, D.; Lohse, M.; Wong, A.; Pufe, J.; Ludwig, F.-A.; Fischer, S.; Hauser, S.; Greif, D.; Pisabarro, M. T.; Pietzsch, J.; Pietsch, M.; Löser, R. Nԑ-Acryloyllysine piperazides as irreversible inhibitors of transglutaminase 2: Synthesis, struc-ture-activity relationships, and pharmacokinetic profiling. J. Med. Chem. 2018, 61, 4528-4560.[Pubmed]
Hauser, C.;* Wodtke, R.;* Löser, R.;# Pietsch, M.# A fluorescence anisotropy-based assay for determining the activity of tissue transglutaminase. Amino Acids 2017, 49, 567-583.[Pubmed]
*, # C. Hauser und R. Wodtke sowie R. Löser und M. Pietsch haben jeweils zu gleichen Teilen zur Publikation beigetragen.
Wodtke, R.; Schramm, G.; Pietzsch, J.; Pietsch, M.; Löser, R. Synthesis and kinetic characterisation of water-soluble fluorogenic acyl donors for transglutaminase 2. ChemBioChem 2016, 17, 1263-1281. Corrigendum: ChemBioChem 2016, 17, 1674.[Pubmed][Corrigendum]
Die Gallensalz-abhängige Cholesterolesterase (CEase) ist an der Entstehung von Entzündungsprozessen, wie z. B. der Atherosklerose und der Rheumatischen Arthritis, beteiligt und daher eine Zielstruktur für die Entwicklung von neuen Hemmstoffen. Zur Bestimmung der CEase-Aktivität wurde ein neuer fluorimetrischer Assay entwickelt und mit Hilfe von literaturbekannten Inhibitoren an den pankreatischen Enzymen aus Mensch, Maus (beide rekombinant in HEK-293 EBNA-Zellen exprimiert) und Rind evaluiert. Zur Abschätzung der Selektivität von identifizierten CEase-Hemmstoffen werden zudem die rekombinant erzeugten, humanen Serinhydrolasen Monoacylglycerollipase (MAGL) und Fettsäureamidhydrolase (FAAH) untersucht, die ähnliche Substrate wie die CEase spalten und selbst ebenfalls Zielstrukturen bei verschiedenen Erkrankungen/pathologischen Prozessen, u.a. Krebs, Schmerz, Entzündungen sowie kardiovaskulären Erkrankungen, darstellen. Entsprechende spektrophotometrische bzw. fluorimetrische Aktivitätsassays zur Charakterisierung von Inhibitoren wurden ebenfalls für diese beiden Enzyme etabliert. Erste Studien an den drei Enzymen zeigen, dass ω-Phthalimidoalkylarylharnstoffe als potente Inhibitoren der murinen und humanen CEase fungieren, wobei die Hemmwirkung gegenüber MAGL und FAAH deutlich geringer ausgeprägt ist. Die strukturell verwandten ω-Chinazolinonylalkylarylharnstoffe wirken hingegen v.a. als reversible Hemmstoffe der MAGL.
Ausgewählte Publikationen:
Dato, F. M.; Neudörfl, J. M.; Gütschow, M.; Goldfuss, B.; Pietsch, M. ω-Quinazolinonylalkyl aryl ureas as reversible inhibitors of monoacylglycerol lipase. Bioorg. Chem. 2020, 94:103352.[Pubmed]
Dato, F. M.; Sheikh, M.; Uhl, R. Z.; Schüller, A. W.; Steinkrüger, M.; Koch, P.; Neudörfl, J.-M.; Gütschow, M.; Goldfuß, B.; Pietsch, M. ω-Phthalimidoalkyl aryl ureas as potent and selective inhibitors of cholesterol esterase. ChemMedChem 2018, 13, 1833-1847.[Pubmed]
Dato, F. M.; Maaßen, A.; Goldfuß, B.; Pietsch, M. Characterization of fatty acid amide hydrolase activity by a fluorescence-based assay. Anal. Biochem. 2018, 546, 50-57.[Pubmed]